การปนเปื้อนของเซลล์เพาะเลี้ยงลดลงอย่างมีประสิทธิภาพ

การปนเปื้อนของเซลล์เพาะเลี้ยงสามารถกลายเป็นปัญหาที่พบบ่อยที่สุดในห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเซลล์ได้อย่างง่ายดาย ซึ่งบางครั้งอาจก่อให้เกิดผลร้ายแรงตามมาสารปนเปื้อนจากการเพาะเลี้ยงเซลล์สามารถแบ่งออกได้เป็น 2 ประเภท สารปนเปื้อนทางเคมี เช่น สารสื่อกลาง สารปนเปื้อนในซีรั่มและน้ำ สารเอนโดทอกซิน พลาสติไซเซอร์และสารซักฟอก และสารปนเปื้อนทางชีวภาพ เช่น แบคทีเรีย รา ยีสต์ ไวรัส การติดเชื้อมัยโคพลาสมาข้ามปนเปื้อนจากเซลล์อื่นๆแม้ว่าจะไม่สามารถกำจัดการปนเปื้อนได้อย่างสมบูรณ์ แต่ความถี่และความรุนแรงสามารถลดลงได้โดยการทำความเข้าใจแหล่งที่มาอย่างละเอียดและปฏิบัติตามเทคนิคปลอดเชื้อที่ดี

1. ส่วนนี้สรุปประเภทหลักของการปนเปื้อนทางชีวภาพ:
การปนเปื้อนของแบคทีเรีย
การปนเปื้อนของเชื้อราและไวรัส
การปนเปื้อนของไมโคพลาสมา
การปนเปื้อนของยีสต์

1.1 การปนเปื้อนของแบคทีเรีย
แบคทีเรียเป็นกลุ่มจุลินทรีย์เซลล์เดียวที่แพร่หลายโดยปกติแล้วพวกมันจะมีเส้นผ่านศูนย์กลางเพียงไม่กี่ไมครอนและสามารถมีรูปร่างได้หลากหลายตั้งแต่ทรงกลมไปจนถึงแท่งและเกลียวเนื่องจากความแพร่หลาย ขนาด และอัตราการเติบโตอย่างรวดเร็ว แบคทีเรียรวมทั้งยีสต์และราจึงเป็นสารปนเปื้อนทางชีวภาพที่พบได้บ่อยที่สุดในการเพาะเลี้ยงเซลล์

1.1.1 การตรวจหาการปนเปื้อนของแบคทีเรีย
การปนเปื้อนของแบคทีเรียสามารถตรวจจับได้ง่ายโดยการตรวจสอบด้วยสายตาของวัฒนธรรมภายในสองสามวันหลังจากติดเชื้อ
เชื้อที่ติดเชื้อมักจะขุ่น (เช่น ขุ่น) บางครั้งมีฟิล์มบางๆ อยู่บนพื้นผิว
การลดลงอย่างกะทันหันของค่า pH ของอาหารเลี้ยงเชื้อก็พบได้บ่อยเช่นกัน
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์กำลังต่ำ แบคทีเรียจะปรากฏเป็นเม็ดเล็ก ๆ ที่เคลื่อนไหวระหว่างเซลล์ และการสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์กำลังสูงสามารถแยกรูปร่างของแบคทีเรียแต่ละชนิดได้

1.2 การปนเปื้อนของเชื้อราและไวรัส
1.2.1 การปนเปื้อนของเชื้อรา
ราเป็นจุลินทรีย์ยูคาริโอตของอาณาจักรเชื้อราที่เติบโตในรูปแบบของเส้นใยหลายเซลล์ที่เรียกว่า hyphaeเครือข่ายที่เชื่อมต่อกันของเส้นใยหลายเซลล์เหล่านี้มีนิวเคลียสที่เหมือนกันทางพันธุกรรมเรียกว่าโคโลนีหรือไมซีเลียม

คล้ายกับการปนเปื้อนของยีสต์ ค่า pH ของเชื้อยังคงคงที่ในช่วงเริ่มต้นของการปนเปื้อน จากนั้นจะเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วเมื่อเชื้อติดเชื้อรุนแรงขึ้นและมีเมฆมากภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ไมซีเลียมมักมีลักษณะเป็นเส้นใย บางครั้งเป็นกลุ่มสปอร์ที่หนาแน่นสปอร์ของราจำนวนมากสามารถอยู่รอดได้ในสภาพแวดล้อมที่รุนแรงและไม่เอื้ออำนวยอย่างยิ่งในช่วงระยะพักตัว และจะเปิดใช้งานก็ต่อเมื่อพบสภาวะการเจริญเติบโตที่เหมาะสมเท่านั้น

1.2.2 การปนเปื้อนของไวรัส
ไวรัสเป็นสารติดเชื้อด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้เครื่องจักรของเซลล์เจ้าบ้านเพื่อการสืบพันธุ์ขนาดที่เล็กมากทำให้ตรวจจับได้ยากในการเพาะเลี้ยงและกำจัดออกจากรีเอเจนต์ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเซลล์เนื่องจากไวรัสส่วนใหญ่มีข้อกำหนดที่เข้มงวดมากสำหรับโฮสต์ของพวกมัน พวกมันจึงไม่ส่งผลเสียต่อเซลล์เพาะเลี้ยงของสปีชีส์อื่นที่ไม่ใช่โฮสต์
อย่างไรก็ตาม การใช้เซลล์เพาะเลี้ยงที่ติดเชื้อไวรัสอาจก่อให้เกิดความเสี่ยงอย่างร้ายแรงต่อสุขภาพของบุคลากรในห้องปฏิบัติการ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากเซลล์ของมนุษย์หรือไพรเมตเติบโตในห้องปฏิบัติการ

การติดเชื้อไวรัสในเซลล์เพาะเลี้ยงสามารถตรวจพบได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน การทำให้ภูมิคุ้มกันบกพร่องด้วยชุดแอนติบอดี ELISA หรือ PCR ด้วยไพรเมอร์ไวรัสที่เหมาะสม

1.3การปนเปื้อนของมัยโคพลาสมา
Mycoplasmas เป็นแบคทีเรียธรรมดาที่ไม่มีผนังเซลล์ และคิดว่าเป็นสิ่งมีชีวิตที่จำลองตัวเองได้น้อยที่สุดเนื่องจากมีขนาดเล็กมาก (โดยปกติจะน้อยกว่า 1 ไมครอน) ไมโคพลาสมาจึงตรวจจับได้ยากจนกว่าจะมีความหนาแน่นสูงมากและทำให้เซลล์เพาะเลี้ยงเสื่อมสภาพจนกว่าจะถึงตอนนั้น มักจะไม่มีสัญญาณที่ชัดเจนของการติดเชื้อ

1.3.1 การตรวจหาการปนเปื้อนของมัยโคพลาสมา
มัยโคพลาสม่าที่เติบโตช้าบางชนิดอาจคงอยู่ในวัฒนธรรมโดยไม่ทำให้เซลล์ตาย แต่พวกมันเปลี่ยนพฤติกรรมและเมแทบอลิซึมของเซลล์เจ้าบ้านในวัฒนธรรม

การติดเชื้อมัยโคพลาสมาแบบเรื้อรังอาจแสดงลักษณะโดยอัตราการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่ลดลง ความหนาแน่นของความอิ่มตัวลดลง และการเกาะติดกันในการเพาะเลี้ยงสารแขวนลอย
อย่างไรก็ตาม วิธีเดียวที่เชื่อถือได้ในการตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อมัยโคพลาสมาคือการทดสอบเพาะเชื้อเป็นประจำโดยใช้การย้อมด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์ (เช่น Hoechst 33258), ELISA, PCR, การย้อมสีภูมิคุ้มกัน, การถ่ายภาพด้วยรังสีอัตโนมัติ หรือการทดสอบจุลินทรีย์

1.4 การปนเปื้อนของยีสต์
ยีสต์เป็นยูคาริโอตเซลล์เดียวของอาณาจักรเชื้อรา มีขนาดตั้งแต่ไม่กี่ไมครอน (ปกติ) ถึง 40 ไมครอน (น้อยครั้ง)

1.4.1 การตรวจหาการปนเปื้อนของยีสต์
เช่นเดียวกับการปนเปื้อนของแบคทีเรีย เชื้อที่ปนเปื้อนด้วยยีสต์อาจขุ่นมัวได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งหากการปนเปื้อนนั้นอยู่ในขั้นสูงค่า pH ของเชื้อที่ปนเปื้อนด้วยยีสต์จะเปลี่ยนแปลงน้อยมากจนกระทั่งการปนเปื้อนรุนแรงขึ้น ซึ่งในขั้นตอนนี้ค่า pH มักจะเพิ่มขึ้นภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ยีสต์จะปรากฏเป็นอนุภาคทรงรีหรือทรงกลมเดี่ยวๆ และอาจสร้างอนุภาคที่เล็กกว่า

2. การติดเชื้อข้าม
แม้ว่าจะไม่เกิดขึ้นบ่อยเท่าการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ แต่การปนเปื้อนข้ามอย่างครอบคลุมของหลายเซลล์ด้วย HeLa และเซลล์ที่เติบโตอย่างรวดเร็วอื่นๆ เป็นปัญหาที่ชัดเจนและมีผลกระทบร้ายแรงขอรับเซลล์ไลน์จากธนาคารเซลล์ที่มีชื่อเสียง ตรวจสอบลักษณะของเซลล์อย่างสม่ำเสมอ และใช้เทคนิคปลอดเชื้อที่ดีวิธีปฏิบัติเหล่านี้จะช่วยให้คุณหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามได้ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ คาริโอไทป์ และไอโซไทป์สามารถยืนยันได้ว่ามีการปนเปื้อนข้ามในเซลล์เพาะเลี้ยงของคุณหรือไม่

แม้ว่าจะไม่เกิดขึ้นบ่อยเท่าการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ แต่การปนเปื้อนข้ามอย่างครอบคลุมของหลายเซลล์ด้วย HeLa และเซลล์ที่เติบโตอย่างรวดเร็วอื่นๆ เป็นปัญหาที่ชัดเจนและมีผลกระทบร้ายแรงรับเซลล์ไลน์จากธนาคารเซลล์ที่มีชื่อเสียง ตรวจสอบลักษณะของเซลล์อย่างสม่ำเสมอ และใช้เทคนิคปลอดเชื้อที่ดีวิธีปฏิบัติเหล่านี้จะช่วยให้คุณหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามได้ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ คาริโอไทป์ และไอโซไทป์สามารถยืนยันได้ว่ามีการปนเปื้อนข้ามในเซลล์เพาะเลี้ยงของคุณหรือไม่